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坑ウイルス

坑ウイルス評価試験法

Tilex抗ウイルス

--one of  indispensable 5 facility--

試験サンプル0.4gにウイルスを接種し、25℃で2時間静置したのち、 プラーク法で感染価を測定します。 試験サンプル0.4gにウイルスを接種し、25℃で2時間静置したのち、 プラーク法で感染価を測定します。JEC301 SEKマーク繊維製品認証基準_25坑ウイルス.jpg

坑ウイルス評価試験手順

試験手順1.png 細菌の50分の1程度の大きさで、とても小さく、自分で細胞を持ちません。ウイルスには細胞がないので、他の細胞に入り込んで生きていきます。ヒトの体にウイルスが侵入すると、ヒトの細胞の中に入って自分のコピーを作らせ、細胞が破裂してたくさんのウイルスが飛び出し、ほかの細胞に入りこみます。このようにして、ウイルスは増殖します

抗ウイルス試験を実施するにあたり、抗菌試験と同様にウイルスを接種する前に、

3~24時間プレ照射してください。

 プレ照射した試料に、ウイルス試験サンプル0.4gを接種し、25で2時間静置後に、
プラーク法で感染価を測定します。

坑ウイルス評価試験法
坑ウイルス試験-プラーク法

坑ウイルス試験-プラーク法

穴6.jpgTCID50 組織培養感染量は、ウイルスの力価を測定するためのシステムです。この手法は、組織培養での細胞変性効果(CPE)を誘発し得るあらゆるウイルスの感染力価を測定することを目的に、培養細胞が生存を維持する5~20日間に�わたって実施します。この手法を実施することで、調製物中の感染性ウイルスの量が定量されます。すべてのウイルス型が組織培養でCPEを誘発するとは限らず、細胞株およびウイルスは、細胞変性効果を調べるために揃えられるという点に注目する必要があります。
プラーク.pngプラークは、被験物質中のウイルスの感染能を測定するのに用いる標準的な生物学的な方法です。プラークは、単一の感染性ウイルス粒子が、その他の点では健康な培養細胞の単層の表面に、細胞病理学上プラークと呼ばれる肉眼で見える単一の領域を生じさせるという仮定に基づいています。単層の単一細胞に単一のウイルス粒子が感染すると、初回感染の結果生じた新しいウイルスは、周りの細胞を感染させることができるため、顕微鏡で見えるプラークを生じます。ウイルス子孫が培養物の他の部分に伝播するのを�防止するため、接種した直後に、細胞単層を半流動寒天培地で覆います。終了時に、単層を生体染色色素で染色することで、細胞単層のプラークが目に見えるようになります。
坑ウイルス-評価基準

坑ウイルス-評価基準

坑ウイルス評価基準.png
24-3 JEC301 SEKマーク繊維製品認証基準_25坑ウイルス.jpg これは、ウイルス負荷試料の段階希釈液で二連のウェルを感染させる定量アッセイです。各ウェルは、CPEを誘発したウイルスの有無に基づいて陽性または陰性のいずれかにスコア化します。
坑ウイルス活性値Mvが、
Mv≧3ならば「大きな効果」
ISO 18184ならびにSEKマーク認定基準 JIS L 1922規定で、Full effct 大きな効果、

3>Mv≧2ならば「小さな効果」
ISO 18184で、Small effect 小さな効果
と評価されます。
評価基準.png ウイルス力価は、Federal Gazette No.84 4 May 1994、およびSchmidt, N.J and Emmons, R.W (1989) in Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection, 6th Editionに記載されているSpearman Kärber計算式に従い算出します。
ウイルスと宿主細胞

ウイルスと宿主細胞

 坑ウイルス効果の評価には、安定して入手可能なウイルスが用いられます。  エンビロープを有するコロナウイルスの坑ウイルス試験には、 A型インフルエンザウイルスH3N2と宿主細胞にはMDCK細胞を、  エンビロープの無いノロウイルスの坑ウイルス試験には、 ネコカリシウイルスF-9と宿主細胞にはCRFK細胞が用いられます。24-2 JEC301 SEKマーク繊維製品認証基準_25坑ウイルス.jpgウイルスを培養するには,宿主となる細胞に感染させてウイルスを増殖させることが必要です。マ ウス,ウサギ,ニワトリ等の実験動物や発育鶏卵,培養細胞に感染させて培養します。実験動物を用 いる試験は倫理上の問題からもなるべく避ける方が望ましいため,弊財団では培養細胞に感染させる 方法を採用しています。インフルエンザウイルスはMDCK細胞(イヌ腎細胞由来)に,アデノウイルス, ヘルペスウイルス,ポリオウイルス(ワクチン株)は HEp-2 細胞(ヒト由来)に,ネコカリシウイルス(食 中毒で問題になっているノロウイルスの近縁種)は CRFK 細胞(ネコ腎細胞由来)に感染させ,ウイルスを培養しています
坑ウイルス効果の評価には、安定して入手可能なウイルスが用いられます。
 エンビロープを有するコロナウイルスの坑ウイルス試験には、
A型インフルエンザウイルスH3N2と宿主細胞にはMDCK細胞を、
 エンビロープの無いノロウイルスの坑ウイルス試験には、
ネコカリシウイルスF-9と宿主細胞にはCRFK細胞が用いられます。
ウイルスの基本構造

ウイルスの基本構造

2020-07-11.jpg  ウイルスは、タンパク質と核酸からなり、代謝と��自己複製を宿主細胞の機能に完全に依存し、サイズは数十~数百nmです。 宿主の種類から、動物ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)と大別、さらにゲノムの種類(DNA/RNA)と構造(一本鎖/二本鎖)で細分されます。   基本的に、核酸(RNAまたはDNA)とタンパク質から成るコアを、カプシド*1  タンパク質で包む構造の殻でヌクレオカプシドを成します。  ヌクレオカプシドだけのウイルスと、さらに脂質二重膜のエンベロープ*2(外套)で包まれたウイルスに区分されます。    エンベロープには、ペントンあるいはスパイク*3と呼ばれる糖タンパ ク質が突出しています。         *1:電子顕微鏡で観察可能な形態学的な構造上の基本単位であり3~6個程度のペプチドで構成される集合体。  *2:宿主の細胞から出芽する際、宿主の細胞質膜や核膜の一部をまとったもの。  *3:ウイルス遺伝子が作る独自のタンパク質であり、宿主細胞に吸着・侵入したり、宿主の免疫機構から逃れたり生理的な作用をします。

ウイルスの基本構造

ウイルスは、タンパク質と核酸からなり、代謝と自己複製を宿主細胞の機能に完全に依存し、サイズは数十~数百nmです。 宿主の種類から、動物ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)と大別、さらにゲノムの種類(DNA/RNA)と構造(一本鎖/二本鎖)で細分されます。

 基本的に、核酸(RNAまたはDNA)とタンパク質から成るコアを、カプシド*1タンパク質で包む構造の殻でヌクレオカプシドを成します。  ヌクレオカプシドだけのウイルスと、さらに脂質二重膜のエンベロープ*2(外套)で包まれたウイルスに区分されます。

  エンベロープには、ペントンあるいはスパイク*3と呼ばれる糖タンパ ク質が突出しています。

     

*1:電子顕微鏡で観察可能な形態学的な構造上の基本単位であり3~6個程度のペプチドで構成される集合体。

*2:宿主の細胞から出芽する際、宿主の細胞質膜や核膜の一部をまとったもの。

*3:ウイルス遺伝子が作る独自のタンパク質であり、宿主細胞に吸着・侵入したり、

  宿主の免疫機構から逃れたり生理的な作用をします。

コロナウイルスCoVの構造
corona-fig1.png  コロナウイルスは、直径約100nm、表面に突起があ�り、電子顕微鏡で見られる外観が王冠(crown, ギリシャ語でコロナ)に似ていることから名づけらました。   ニドウイルス目・コロナウィルス亜科・コロナウィルス科に分類。   脂質二重膜のエンビロープ(E)の中に、Nucleo capsid(N)に巻き付いた1本鎖RNAゲノム(Positive strand RNA)が入っています。   エンビロープ表面に、Spike(S)蛋白、エンビロープ(E)蛋白、Membrane(M)蛋白が存在しています。

コロナウイルスCoVの構造

 コロナウイルスCoVは、直径約100nm、表面に突起があり、電子顕微鏡で見られる外観が王冠(crown, ギリシャ語でコロナ)に似ていることから名づけらました。

 ニドウイルス目・コロナウィルス亜科・コロナウィルス科に分類。

 脂質二重膜のエンビロープ(E)の中に、Nucleo capsid(N)に巻き付いた1本鎖RNAゲノム(Positive strand RNA)が入っています。

 エンビロープ表面に、Spike(S)蛋白、エンビロープ(E)蛋白、Membrane(M)蛋白が存在しています。

ref. NIID 国立感染症研究所

SARSコロナウイルス

SARSコロナウイルス

SARS 1280px-Coronaviruses_004_lores.jpg  コロナウィルスSARS-CoVは,2002年11月に中国の広東省で最初に検出され,その後30を超える国々に拡大しました。このアウトブレイクで、世界中で8,000例以上の症例と774例の死亡が報告されています(死亡率は約10%であるが,24歳以下では1%未満,65歳以上では50%以上と、年齢によるばらつきが大きい)。   CDC (Centers for Disease Control and Prevention)が特定地域への旅行中止を推奨したのは,このSARS-CoVのアウトブレイクが最初の事例であった。このアウトブレイクは鎮静化し,2004年以降新たな症例は同定されていない��。   直接の発生源はジャコウネコであると推定されています。生きた動物を売買する市場で食材として販売されていたジャコウネコは商用として捕獲される前にコウモリとの接触を介して感染した可能性が高いとされています。   コウモリはしばしばコロナウイルスの宿主となることが知られています。

コロナウィルスSARS-CoVは,2002年11月に中国の広東省で最初に検出され,その後30を超える国々に拡大しました。このアウトブレイクで、世界中で8,000例以上の症例と774例の死亡が報告されています(死亡率は平均約10%,24歳以下では1%未満,65歳以上では50%以上と、年齢によるばらつきが大きい)

 CDC (Centers for Disease Control and Prevention)が特定地域への旅行中止を推奨したのは,このSARS-CoVのアウトブレイクが最初の事例となっています。このアウトブレイクは鎮静化し,2004年以降新たな症例は同定されていません。

 直接の発生源はジャコウネコであると推定されています。生きた動物を売買する市場で食材として販売されていたジャコウネコは商用として捕獲される前にコウモリとの接触を介して感染した可能性が高いとされています。

 コウモリは、しばしばコロナウイルスの宿主となることが知られています。

重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス(SARS-CoV)電子顕微鏡写真

新型コロナウイルスCoV 〔COVID-19〕

COVID-19新型SARSコロナウイルス

2019nCoV-200130monos_niid2019-nCoVの電子顕微鏡写真 新型コロナウイルス感染症Covid-19は、2019年12月、中華人民共和国湖北省武漢市において確認されました。   世界保健機関(WHO)は、2020年1月30日、新型コロナウイルス感染症Covid-19について、「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態(PHEIC)」を宣言、さらに3月11日に世界的な感染拡大の状況、重症度等から新型コロナウイルス感染症Covid-19をパンデミック(世界的な大流行)とみなせると宣言しました。     このパンデミック宣言と対策の遅れから8月20日現在、世界の新規感染者数が2,200万と, 6月下旬に10,000万人を超え僅か1カ月半で2.2倍に増加し、死者も累積78万人と拡大傾向に歯止めがかかっていません。  ​ 2020年8月現在まで、新型CoVの詳細は完全に解明されていませんが、核RNAが1本鎖であり変異は複数RNAウイルス程頻繁には生じないと考えられています。

NIID研究所が分離に成功した新型SARSコロナウイルス SARS-CoV-2の電顕写真

  新型コロナウイルスSARS-CoV-2感染症COVID-19は、2019年12月、中華人民共和国湖北省武漢市にて確認されました。

 世界保健機関WHOは、新型コロナ感染症COVID-19について、翌2020年1月30日 "国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態(PHEIC)"、同年3月11日に世界的な感染拡大の状況・重症度等からCOVID-19をパンデミック(世界的な大流行)と宣言しました。

  米Johns Hopkins大学CSSEは , 2020年1月22日からCOVID-19の情報収集開始、2020年6月14日に感染者1,000万, 2021年8月5日2億, 2022年2月9日4億, 20224月13日5億、2022年8月28日6億, 2023年3月10日に6億7,660万, 死者688万と最後の報告をしました。3年有余の長い期間情報収集に尽力された事に心から感謝します。

   新型コロナウイルスの核RNAは長い1本鎖のため2週間程度の短期間で変異を繰り返しています。WHOが "VOC 懸念される変異株分類するN501Yイギリス型α株, E484K南アフリカ型β株 , E484Qブラジル型γ株,  L452Rインド型δ株 , BA.1/ BA.2/ BA.4/ BA.5/ BQ.1.1/ XBB.1.5型 οオミクロ株など感染力と毒性の強い変異種, またVOI 注目すべき変異株"  分類される米国型ι 株, インド型κなど多数派生しています。mRNAワクチン接種や3CLプロテアーゼ阻害剤服用などCOVID-19を封じ込め,さらに後遺症の発症を抑えることを願います。

MERSコロナウイルス

MERSコロナウイルス

MERS-neg.jpg 2012年9月22日に英国よりWHOに対し、中東へ渡航歴のある重症肺炎患者から新種のコロナウイルスMiddle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-CoV)が分離されたとの報告がありました。   中東地域に居住または渡航歴のある者、あるいはMERS患者との接触歴のある者において、中東呼吸器症候群(MERS)の症例が継続的に報告され、医療施設や家族内等において限定的なヒト-ヒト感染が確認されています。

2012年9月22日に英国よりWHOに対し、中東へ渡航歴のある重症肺炎患者から新種のコロナウイルスMiddle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-CoV)が分離されたとの報告がありました。

 中東地域に居住または渡航歴のある者、あるいはMERS患者との接触歴のある者において、中東呼吸器症候群(MERS)の症例が継続的に報告され、医療施設や家族内等において限定的なヒト-ヒト感染が確認されています。

MERSコロナウイルス電顕写真

(国立感染症研究所ウイルス第三部・感染症疫学センター)

インフルエンザ ウイルス

インフルエンザ ウイルス

インフルエンザウイルスA型H1N1 30,000倍 pdm 001.jpg インフルエンザとは、小児から成人、高齢者まで幅広い年齢層で起こる感染症です。通常の風邪と違い、コロナウイルスのインフルエンザウイルス罹患によってもたらされます。ヒポクラテスの時代「突如として発生して瞬く間に広がり数ヶ月の内に消えて行く…」とか、我国の「増鏡」に「しはぶき(咳)やみはやりて人多く失わせたまう…」などと記載されているなど、昔からの流行病です。インフルエンザという言葉もこの流行(influence)を意味しています。  1918年に流行したスペインかぜは全世界で罹患患者数6億人、死亡者数2,000~4,000万人、我国でも罹患患者数2,300万人、死亡者数38万人にも上る大流行で、今回のCovid-19に似た挙動を��示していました。   なお現在でも、世界的に流行しているインフルエンザウイルスは、H3N2の香港かぜ、H1N1のソ連かぜが主体です。

  インフルエンザとは、小児から成人、高齢者まで幅広い年齢層で起こる感染症です。通常の風邪と違い、コロナウイルスCoVのインフルエンザウイルス罹患によってもたらされます。ヒポクラテスの時代「突如として発生して瞬く間に広がり数ヶ月の内に消えて行く…」とか、我国の「増鏡」に「しはぶき(咳)やみはやりて人多く失わせたまう…」などと記載されているなど、昔からの流行病です。インフルエンザという言葉もこの流行(influence)を意味しています。
 1918年に流行したスペインかぜは全世界で罹患患者数6億人、死亡者数2,000~4,000万人、我国でも罹患患者数2,300万人、死亡者数38万人を上回る大流行で、今回のCOVID-19に似た挙動を示していました。

 なお現在でも、世界的に流行しているインフルエンザウイルスは、H3N2の香港かぜ、H1N1のソ連かぜが主体です。

インフルエンザH1N1ウイルス電顕写真(国立感染症研究所提供) 

インフルエンザウイルスH3N2

インフルエンザウイルスH3N2

インフルエンザH3N2説明図.jpg左の模式図に示すインフルエンザウイルスはA,B,Cの3型に大別されるコロナウイルスです。A型とB型は世界的な流行を齎します。   A型とB型インフルエンザウイルスは、粒 子表面には赤血球凝集素HAとノイラミニダーゼNA糖 蛋白があり、これらが感染防御免疫の標的抗原となり感染します。A型HAは15種類、NAは9種類の抗原性の異なる亜型に分類されます。 インフルエンザウイルスは、1本鎖RNAのCovid-19と異なり複数のRNAで構成されており、RNAが宿主細胞内で分離、互いに混ざり合うことで変異する特性を有しています。A型インフルエンザは、不連続抗原変異(antigenic shift)で別の亜型ウイルスとなり、数年~数十年ごとに全世界的な大流行しています。     1918年スペインかぜH1N1の発生     1957年アジアか ぜH2N2の発生     1968年香港型H3N2の発生     1977年ソ連型H1N1の発生  現在なおA型のH3N2とH1N1が流行しています。 

インフルエンザウイルス模式図

 模式図に示すインフルエンザウイルスは A, B, Cの3型に大別されるコロナウイルスCoVです。A型とB型は世界的な流行を齎します。

 A型とB型インフルエンザウイルスは、粒 子表面には赤血球凝集素HAとノイラミニダーゼNA糖 蛋白があり、これらが感染防御免疫の標的抗原となり感染します。A型HAは15種類、NAは9種類の抗原性の異なる亜型に分類されます。

 インフルエンザウイルスは、1本鎖RNAのCOVID-19と異なり複数のRNAで構成されており、RNAが宿主細胞内で分離、互いに混ざり合うことで変異しやすい特性を有しています。A型インフルエンザは、不連続抗原変異(antigenic shift)で別の亜型ウイルスとなり、数年~数十年ごとに全世界的な大流行しています。

   1918年スペインかぜH1N1の発生

   1957年アジアか ぜH2N2の発生

   1968年香港型H3N2の発生

   1977年ソ連型H1N1の発生

現在なおA型のH3N2とH1N1が流行しています。 

TX製品坑ウイルス試験

Tilex製品坑ウイルス試験 -インフルエンザウイルス

 量子触媒TX7を密度3g/平方mで含侵したガーゼタオル注のA型インフルエンザウイルスH3N2感染価を測定しました。   結果、坑ウイルス機能が「大きな効果」と評価されました。   試験ウイルス:A型インフルエンザウイルス(H3N2), A/Hong Kong/8/68;TC adapted ATCC VR-1679  宿主細胞:MDCK細胞(イヌ腎臓由来細胞)  量子触媒:TX7  放置条件:25℃ 2時間 インフルエンザウイルスは、1本鎖RNAのCovid-19と異なり複数のRNAで構成されており、RNAが宿主細胞内で分離、互いに混ざり合うことで変異する特性を有しています。A型インフルエンザは、不連続抗原変異(antigenic shift)で別の亜型ウイルスとなり、数年~数十年ごとに全世界的な大流行しています。     1918年スペインかぜH1N1の発生     1957年アジアか ぜH2N2の発生     1968年香港型H3N2の発生     1977年ソ連型H1N1の発生  現在なおA型のH3N2とH1N1が流行しています。 インフルエンザウイルス_ページ_6 - コピー.tiff

 共同研究パートナーのおぼろタオル社様とTilex社が共同開発したガーゼタオル注1の抗ウイルス機能を試験し、ウイルス感染価Mv値が3.75でした。

感染価Mv=3.75は、「 Mv≧3の 大きな効果」に該当し、十分な抗ウイルス機能を有することを実証しました。

 試験条件は、次のとおりです。

使用触媒:Tilex量子触媒TX7 

触媒含侵密度: 3g/平方m 

試験ウイルス:A型インフルエンザウイルスH3N2,      A/Hong Kong/8/68;TC adapted ATCC VR-1679

宿主細胞:MDCK細胞(イヌ腎臓由来細胞)

放置条件:25 2時間

プレ照射:  なし 注2

注1: おぼろタオル社製市販品ガーゼタオル

注2:プレ照射は必須ですが、ここでは試験機関の都合により未実施

TX製品坑ウイルス試験法
ウイルス感染価の測定手順を、簡単に纏めました。  ・宿主細胞にH3N2ウイルス感染、培養し、精製して、試験ウイルス懸濁液を作成  ・量子触媒TX7含侵ガーゼ検体と標準布に、それぞれ0.2mL接種。  ・25℃、2時間放置し、ガーゼ検体と標準布からウイルスを洗い出し、プラーク測定法にてウイルス感染価を測定インフルエンザウイルス_ページ_7.tiff宿主細胞検証試験:  ・細胞毒性の有無を確認   検体がウイルスの宿主細胞内での増殖を阻害しないことをプラーク法で確認します  ・ウイルスへの細胞の感受性が無いことを確認します   

Tilex製品坑ウイルス試験法 -インフルエンザウイルス

ウイルス感染価の測定手順を、簡単に纏めました。

・宿主細胞にH3N2ウイルス感染、培養し、精製して、試験ウイルス懸濁液を作成

・量子触媒TX7含侵ガーゼ検体と標準布に、それぞれ0.2mL接種。

・25℃、2時間放置し、ガーゼ検体と標準布からウイルスを洗い出し、プラーク測定法にてウイルス感染価を測定

宿主細胞検証試験:

・細胞毒性の有無を確認

 検体がウイルスの宿主細胞内での増殖を阻害しないことをプラーク法で確認します

・ウイルスへの細胞の感受性が無いことを確認します

 

アンカー 2
TX製品坑ウイルス-試験結果

Tilex製品坑ウイルス試験結果 -インフルエンザウイルス-

量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス機能の評価:  ​・細胞毒性が確認されない、  ・ウイルスへの細胞の感受性が低下していない、  2点を確認できれば、  坑ウイルス機能は、2時間放置後の標準布のPFU値と検体のPFU値との差で与えられます。  ​ 量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス試験結果から、標準布6.05と検体2.30の差3.75が、坑ウイルス機能となり、値3以上の大きな効果と評価されます。   なお、ウイルス残留率は、10の-3.75べき乗で与えられ、1/5600です。  ​  ​  ​インフルエンザウイルス_ページ_8.tiff

量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス機能の評価:

​・細胞毒性が確認されない、

・ウイルスへの細胞の感受性が低下していない、

2点を確認できれば、

坑ウイルス機能は、2時間放置後の標準布のPFU値と検体のPFU値との差で与えられます。

​ 量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス試験結果から、標準布6.05と検体2.30の差が坑ウイルス機能のMv値でありMv=3.75と、3以上の大きな効果と評価されます。

 なお、ウイルス残留率は、10の-3.75べき乗で与えられ、2時間後には1/5,600となります。

 Tilex量子触媒は、ウイルスのスパイク構造などに影響されません。開発が期待されているプロテアーゼ阻害剤と同様に、量子触媒はウイルスやその変異株すべてに対して、抗ウイルス機能を発現することが大きな特徴です。​

TX製品坑ウイルス-宿主細胞

Tilex製品坑ウイルス試験-インフルエンザウイルス宿主細胞

宿主.jpg量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス機能の評価:  ​・細胞毒性が確認されない、  ・ウイルスへの細胞の感受性が低下していない、  2点を確認できれば、  坑ウイルス機能は、2時間放置後の標準布のPFU値と検体のPFU値との差で与えられます。  ​ 量子触媒含侵ガーゼの坑ウイルス試験結果から、標準布6.05と検体2.30の差3.75が、坑ウイルス機能となり、値3以上の大きな効果と評価されます。   なお、ウイルス残留率は、10の-3.75べき乗で与えられ、1/5600です。  ​  ​  ​
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